CRISPR: dalla scoperta all’editing genetico moderno

Che cos’è CRISPR in natura

Un locus CRISPR è formato da brevi sequenze ripetute, chiamate repeat, alternate a sequenze variabili dette spacer. Molti spacer derivano da batteriofagi, plasmidi o altri elementi genetici mobili con cui il microrganismo è entrato in contatto.
Le ripetizioni non sono sempre palindromi perfetti, nonostante il nome storico. Possono però formare strutture utili alla maturazione degli RNA. A un’estremità dell’array si trova in genere una regione detta leader, che contiene elementi regolatori e indica il lato nel quale vengono integrati più frequentemente i nuovi spacer. Nelle vicinanze sono spesso presenti i geni cas.

Il tratto del genoma invasore da cui deriva uno spacer viene chiamato protospacer. La distinzione è importante:

• lo spacer si trova nell’array CRISPR del microrganismo;
• il protospacer è la sequenza corrispondente presente nel virus, nel plasmide o nel DNA bersaglio;
• il PAM è un breve motivo adiacente al protospacer, necessario per il riconoscimento in molti sistemi CRISPR-Cas.

Un batterio non costruisce da zero l’intero sistema CRISPR a ogni infezione. Eredita il locus e i geni cas dalle cellule progenitrici, ma può aggiornare la propria memoria incorporando nuovi spacer.

Come nasce e agisce la memoria immunitaria CRISPR

Il funzionamento naturale può essere diviso in tre fasi: adattamento, espressione e interferenza.

1. Adattamento: acquisizione di un nuovo spacer

Quando un batterio viene infettato da un batteriofago, una parte del materiale genetico estraneo può essere selezionata come protospacer.
Le proteine Cas1 e Cas2, conservate in molti sistemi, formano il nucleo del complesso che acquisisce questa sequenza. Il frammento viene integrato nell’array CRISPR, di solito vicino alla regione leader. Durante l’inserimento viene duplicata una delle ripetizioni, così il nuovo spacer rimane compreso tra due repeat.
La cellula acquisisce in questo modo una memoria molecolare dell’invasore, che può essere trasmessa alle cellule figlie.

La scelta del protospacer non è completamente casuale. In diversi sistemi dipende dalla presenza di particolari motivi adiacenti e dall’accessibilità del DNA. Non tutte le cellule di una popolazione acquisiscono necessariamente lo stesso spacer, creando una diversità che può aumentare la probabilità di resistere a infezioni future.

2. Espressione: produzione degli RNA CRISPR

L’intero array viene trascritto in un lungo precursore chiamato pre-crRNA. Questo RNA viene poi tagliato in molecole più piccole, ciascuna contenente uno spacer e una parte della ripetizione. Il prodotto maturo è il crRNA, che conserva l’informazione necessaria per riconoscere la sequenza complementare.

Il processo di maturazione cambia tra i diversi sistemi CRISPR. Nel sistema di tipo II, al quale appartiene Cas9, interviene un secondo RNA chiamato tracrRNA.
Il tracrRNA si appaia alle ripetizioni del pre-crRNA e, insieme a Cas9 e all’enzima RNasi III, contribuisce alla formazione degli RNA guida maturi.

3. Interferenza: riconoscimento e distruzione dell’invasore

Durante una nuova infezione, il crRNA indirizza la proteina Cas verso un acido nucleico complementare.
Nel caso di Cas9, il complesso cerca innanzitutto un motivo PAM compatibile e verifica poi l’appaiamento tra RNA guida e DNA.
Per la Cas9 di Streptococcus pyogenes, abbreviata in SpCas9, il PAM più comune è 5’-NGG-3’, dove N può essere una qualunque base. Se il bersaglio è sufficientemente complementare, Cas9 forma un ibrido RNA-DNA e separa localmente i due filamenti del DNA.

Cas9 contiene due domini nucleasici principali: HNH taglia il filamento complementare all’RNA guida, mentre RuvC recide il filamento opposto. Il risultato è una rottura a doppio filamento, in genere circa tre nucleotidi a monte del PAM.
Il PAM contribuisce anche a distinguere il DNA estraneo dall’array CRISPR del batterio. La sequenza dello spacer è presente nel genoma microbico, ma normalmente non è affiancata dallo stesso PAM riconosciuto nel DNA invasore. In questo modo si riduce il rischio che il sistema tagli la propria memoria genetica.

Come si è evoluto il sistema CRISPR-Cas

CRISPR-Cas è il risultato della lunga coevoluzione tra microrganismi ed elementi genetici mobili.
I batteriofagi possono sfuggire al riconoscimento modificando il protospacer o il PAM. Alcuni producono persino proteine anti-CRISPR, capaci di bloccare le proteine Cas. I batteri, a loro volta, possono acquisire nuovi spacer o utilizzare sistemi CRISPR differenti.

L’origine evolutiva esatta non è ancora completamente chiarita. La genomica comparata suggerisce che CRISPR-Cas si sia formato combinando moduli con storie diverse.
Il sistema di adattamento basato su Cas1 e Cas2 potrebbe essere collegato a elementi mobili chiamati casposoni, mentre i moduli effettori avrebbero avuto più origini evolutive.

Non tutti i batteri e gli archei possiedono CRISPR. Mantenere il sistema ha un costo biologico e può provocare autoimmunità se viene acquisito uno spacer contro il proprio genoma. La presenza di CRISPR dipende quindi dal bilancio tra protezione dai virus, costi cellulari e possibilità di acquisire DNA utile mediante trasferimento genico orizzontale.

Come funziona CRISPR/Cas9 in laboratorio

In laboratorio, crRNA e tracrRNA possono essere riuniti in una singola molecola chiamata single-guide RNA o sgRNA. Una parte dello sgRNA interagisce con Cas9, mentre una regione di circa 20 nucleotidi viene progettata per riconoscere il bersaglio.

L’esperimento segue in genere questa sequenza:

1. si identifica nel DNA una sequenza vicina a un PAM compatibile;
2. si progetta un RNA guida complementare al bersaglio;
3. Cas9 e lo sgRNA vengono introdotti nelle cellule;
4. il complesso riconosce il PAM e verifica la complementarità;
5. Cas9 taglia il DNA;
6. i sistemi cellulari riparano la rottura.

L’RNA guida determina gran parte della specificità, mentre Cas9 esegue il taglio. La proteina non sceglie autonomamente un gene: viene indirizzata dall’appaiamento tra RNA e DNA e dalla presenza del PAM.

Complementarità non significa identità. Se un filamento di DNA è scritto come 5’-AGTC-3’, la sequenza di RNA complementare e antiparallela è 3’-UCAG-5’. Scritta nella direzione convenzionale 5’-3’, diventa 5’-GACU-3’. Nell’RNA, inoltre, l’uracile sostituisce la timina.
Il PAM appartiene al DNA bersaglio e non viene copiato nella regione guida dello sgRNA. Questa distinzione è una delle più importanti nei quesiti sul funzionamento di CRISPR/Cas9.

Dopo il taglio: NHEJ, HDR e risultato dell’editing

La metafora delle forbici molecolari descrive solo una parte del processo.
Cas9 produce una lesione, ma il risultato dipende soprattutto dal modo in cui la cellula ripara il DNA.
La giunzione non omologa delle estremità, o non-homologous end joining (NHEJ), ricongiunge rapidamente i filamenti senza usare un lungo modello omologo. La riparazione può generare piccole inserzioni o delezioni, chiamate nel complesso indel.

Se un’indel altera la cornice di lettura o introduce un codone di stop, il gene può perdere la propria funzione. Per questo la NHEJ viene sfruttata per produrre un knockout. Gli esiti non sono completamente casuali: la sequenza locale e i meccanismi di riparazione rendono alcune modifiche più frequenti di altre.

Anche la riparazione mediata da micro-omologie può generare delezioni prevedibili tra brevi sequenze simili. Questo processo viene spesso incluso tra le forme alternative di giunzione delle estremità.
La riparazione diretta dall’omologia, o HDR, usa invece una sequenza omologa come modello. Fornendo un DNA donatore, è possibile correggere una variante, sostituire una sequenza o inserire un nuovo frammento. La HDR è generalmente più efficiente nelle cellule in divisione e compete con meccanismi di riparazione più rapidi.

In sintesi:

• NHEJ o riparazione alternativa: produce spesso indel e viene usata soprattutto per inattivare un gene;
• HDR: permette modifiche definite, ma richiede un modello donatore ed è spesso meno efficiente;
• risultato funzionale: deve essere verificato a livello di DNA, RNA, proteina e fenotipo.

La scomparsa di una proteina dimostra un effetto funzionale, ma non identifica da sola tutte le variazioni avvenute nel DNA.

La scoperta di CRISPR: le tappe fondamentali

La scoperta di CRISPR non coincide con un singolo esperimento. È il risultato di osservazioni microbiologiche, confronti bioinformatici e studi biochimici condotti da numerosi gruppi nell’arco di oltre vent’anni.

Il Nobel del 2020 ha premiato due contributi fondamentali, ma la ricostruzione storica mostra che CRISPR deriva da un lavoro collettivo.
Gli studi di Ishino, Mojica, Jansen, Barrangou, Horvath, Deltcheva, Šikšnys e di molti altri ricercatori sono stati indispensabili per passare dall’osservazione delle ripetizioni all’editing genomico.

Non esiste solo Cas9: classi e tipi di sistemi CRISPR

I sistemi CRISPR-Cas vengono raggruppati in due grandi classi, sei tipi principali e numerosi sottotipi. La classificazione dipende dall’organizzazione delle proteine coinvolte nell’interferenza.

Cas9 è diventata particolarmente popolare perché concentra molte funzioni in una sola proteina. Non è però adatta a ogni bersaglio. Cas12 riconosce PAM differenti e può generare tagli diversi, mentre Cas13 permette di intervenire sull’RNA senza modificare direttamente il genoma.

L’attività collaterale di Cas12 e Cas13 viene sfruttata in test diagnostici: dopo il riconoscimento del bersaglio, l’enzima taglia molecole reporter producendo un segnale rilevabile. In questo caso CRISPR viene usato per identificare una sequenza, non per modificare il DNA di una cellula.

Strumenti derivati da CRISPR

La piattaforma CRISPR è stata ampliata modificando Cas9 o collegandola ad altri enzimi.

• CRISPR interference e CRISPR activation: una Cas9 cataliticamente inattiva, detta dCas9, si lega al DNA senza tagliarlo. Può ostacolare la trascrizione oppure trasportare attivatori e repressori verso un gene.
• Base editing: una Cas9 modificata viene unita a un enzima capace di convertire una base in un’altra, senza produrre necessariamente una rottura a doppio filamento.
• Prime editing: una Cas9 nickasi viene associata a una trascrittasi inversa e a un RNA guida esteso, chiamato pegRNA, che contiene anche l’informazione per la modifica desiderata.
• Editing epigenetico: dCas9 può trasportare enzimi che modificano cromatina o metilazione, regolando un gene senza cambiare la sequenza del DNA.

Questi strumenti possono aumentare la precisione o rendere possibili modifiche diverse, ma non sono privi di errori. Anche il base editing e il prime editing richiedono controlli sugli effetti indesiderati e sull’efficienza reale.

Le principali applicazioni di CRISPR

CRISPR viene utilizzata in ambiti differenti:

• ricerca di base: creazione di knockout, modelli cellulari e animali, studio della funzione dei geni e screening su larga scala;
• medicina: modifica ex vivo di cellule del paziente e sperimentazione di trattamenti in vivo per malattie genetiche, tumori e altre patologie;
• agricoltura: sviluppo di piante resistenti a malattie, stress ambientali o con caratteristiche qualitative differenti;
• microbiologia industriale: selezione di ceppi più resistenti ai batteriofagi e ottimizzazione della produzione di alimenti, enzimi o molecole di interesse;
• diagnostica molecolare: identificazione di DNA o RNA mediante sistemi basati soprattutto su Cas12 e Cas13;
• biologia sintetica: costruzione di circuiti genetici e controllo programmabile dell’espressione genica.

Queste applicazioni non sono equivalenti.
Un test diagnostico basato su Cas13 non modifica il paziente, mentre una terapia in vivo deve consegnare l’editor nelle cellule corrette e controllare gli effetti nel tempo.

Casgevy: un’applicazione terapeutica concreta

Casgevy, o exagamglogene autotemcel, è stata la prima terapia basata su CRISPR autorizzata da un’autorità regolatoria. Viene impiegata per specifici pazienti con β-talassemia trasfusione-dipendente o anemia falciforme.
È una terapia cellulare autologa ed ex vivo.
Le cellule staminali ematopoietiche CD34+ vengono raccolte dal paziente e modificate in laboratorio con CRISPR/Cas9. Dopo un trattamento di condizionamento, le cellule vengono reinfuse affinché ripopolino il midollo osseo.

Casgevy non corregge direttamente la mutazione del gene HBB.
Il trattamento altera un enhancer eritroide del gene BCL11A. Poiché BCL11A reprime la produzione di emoglobina fetale dopo la nascita, la modifica riduce questa repressione e aumenta l’emoglobina fetale.
L’intervento sull’enhancer è progettato per agire soprattutto nella linea eritroide, evitando di eliminare globalmente le altre funzioni biologiche di BCL11A. La riparazione mediante NHEJ produce indel che interrompono la regione regolatoria: è quindi un esempio di inattivazione funzionale, non di correzione diretta della variante patologica.

Casgevy è stata autorizzata nel Regno Unito nel novembre 2023, negli Stati Uniti per l’anemia falciforme nel dicembre 2023 e nell’Unione europea nel febbraio 2024. Nei dati valutati dall’EMA, 39 pazienti su 42 con β-talassemia hanno raggiunto l’indipendenza dalle trasfusioni per almeno 12 mesi consecutivi. Ventotto pazienti su 29 con anemia falciforme non hanno avuto crisi vaso-occlusive severe per almeno 12 mesi consecutivi.

Gli studi erano a braccio singolo e il monitoraggio prosegue nel tempo. Inoltre, una parte rilevante dei rischi clinici deriva dal condizionamento mieloablativo necessario prima della reinfusione, non soltanto dall’editing genetico.

Limiti, sicurezza ed effetti indesiderati

La programmabilità di CRISPR non implica che ogni modifica sia perfettamente controllabile. Bisogna distinguere almeno cinque problemi.

Il sequenziamento del genoma può contribuire a identificare variazioni inattese, ma non è sufficiente da solo a escludere eventi rari. Deve essere affiancato da analisi mirate, saggi funzionali e metodi sensibili alle alterazioni strutturali.

Anche il tipo di cellula conta.
Un errore in una cellula destinata a vivere pochi giorni ha conseguenze diverse rispetto a un errore in una cellula staminale capace di produrre molte generazioni cellulari. Per questo la valutazione del rischio deve considerare sia la frequenza dell’evento sia il suo possibile impatto biologico.

Questioni etiche: cellule somatiche, linea germinale e gene drive

L’editing delle cellule somatiche riguarda il singolo paziente e non viene trasmesso ai discendenti.
L’editing di embrioni, gameti o cellule della linea germinale può invece produrre modifiche ereditarie. Le incertezze scientifiche e le conseguenze sulle generazioni future rendono questo impiego molto più controverso e sottoposto a forti limitazioni.

Un altro tema è rappresentato dai gene drive, sistemi progettati per aumentare la probabilità che una modifica venga ereditata.
Potrebbero essere usati per controllare organismi vettori di malattie, ma una loro diffusione nell’ambiente potrebbe risultare difficile da arrestare e avere effetti ecologici non previsti.

La discussione etica comprende anche equità di accesso, costi delle terapie, consenso informato e distinzione tra trattamento di una malattia e potenziamento di caratteristiche umane.

Un metodo efficace per studiare CRISPR

Per fissare i concetti, costruisci una mappa con cinque nodi: origine naturale, componenti, fasi del meccanismo, riparazione e applicazioni. Collega ogni nodo a una domanda precisa:

1. Da dove proviene l’informazione contenuta negli spacer?
2. Quale molecola riconosce il bersaglio?
3. Quale proteina esegue il taglio?
4. Quale meccanismo ripara il DNA?
5. Come viene verificato il risultato?

Memorizza anche le differenze tra i termini fondamentali:

Nei quesiti su SpCas9, individua prima il PAM 5’-NGG-3’, poi determina il protospacer e considera un taglio circa tre nucleotidi a monte. Infine, stabilisci se l’esperimento punta a ottenere un knockout mediante NHEJ o una modifica definita mediante HDR.

Quando analizzi un esperimento, separa sempre bersaglio, intervento e misura finale. Un cambiamento nel fenotipo non dimostra automaticamente che sia avvenuta una sola modifica genetica, così come la presenza di un’indel non garantisce che la funzione del gene sia stata eliminata.

Domande frequenti su CRISPR

CRISPR e Cas9 sono la stessa cosa?

No. CRISPR indica le sequenze di memoria e, per estensione, la piattaforma tecnologica. Cas9 è una delle proteine effettrici che possono essere guidate verso il DNA. Esistono sistemi CRISPR che non utilizzano Cas9.

CRISPR è naturale o artificiale?

Il sistema CRISPR-Cas è naturale e si è evoluto nei batteri e negli archei. L’editing genomico è una sua riprogrammazione artificiale: i ricercatori progettano la guida e scelgono il bersaglio.

CRISPR modifica sempre il DNA?

No. Cas13 agisce sull’RNA, mentre dCas9 può regolare la trascrizione senza tagliare il genoma. Anche i test diagnostici basati su CRISPR riconoscono acidi nucleici senza modificare geneticamente il paziente.

CRISPR può correggere qualsiasi mutazione?

Non automaticamente. La fattibilità dipende dal PAM disponibile, dal tipo di cellula, dal sistema di consegna, dalla via di riparazione e dalla possibilità di controllare gli effetti indesiderati. Riconoscere con precisione un bersaglio non significa poter imporre con la stessa precisione il risultato finale.